Isolere klonen
Generelt blir kloning utført for å oppnå klonen av ett bestemt gen eller DNA-sekvens av interesse. Neste trinn etter kloning er derfor å finne og isolere den klonen blant andre bibliotekmedlemmer. Hvis biblioteket omfatter hele genomet til en organisme, vil et sted i biblioteket være den ønskede klonen. Det er flere måter å finne det på, avhengig av det aktuelle genet. Oftest brukes et klonet DNA-segment som viser homologi med det søkt genet, som en sonde. For eksempel, hvis et musegen allerede er klonet, kan den klonen brukes til å finne den ekvivalente humane klonen fra et humant genomisk bibliotek. Bakteriekolonier som utgjør et bibliotek dyrkes i en samling av petriskåler. Deretter legges en porøs membran over overflaten på hver plate, og celler fester seg til membranen. Cellene blir sprukket, og DNA blir separert i enkeltstrenger - alt på membranen. Sonden er også separert i enkeltstrenger og merket, ofte med radioaktiv fosfor. En løsning av den radioaktive sonden blir deretter brukt til å bade membranen. Den enstrengede sondens DNA vil bare feste seg til DNAet til klonen som inneholder det ekvivalente genet. Membranen tørkes og plasseres mot et ark med strålingsfølsom film, og et sted på filmene vil det vises en svart flekk som kunngjør tilstedeværelsen og plasseringen av den ønskede klonen. Klonen kan deretter hentes fra de originale petriskålene.
genetikk: Rekombinant DNA-teknologi og polymerasekjedereaksjonen
Tekniske fremskritt har spilt en viktig rolle i fremrykket av genetisk forståelse. I 1970 amerikanske mikrobiologer Daniel Nathans
DNA-sekvensering
Når et segment av DNA er klonet, kan dets nukleotidsekvens bestemmes. Nukleotidsekvensen er det mest grunnleggende kunnskapsnivået om et gen eller genom. Det er blåkopien som inneholder instruksjonene for å bygge en organisme, og ingen forståelse av genetisk funksjon eller evolusjon kan være fullstendig uten å få denne informasjonen.
Bruker
Kunnskap om sekvensen til et DNA-segment har mange bruksområder, og noen eksempler følger. For det første kan den brukes til å finne gener, DNA-segmenter som koder for et spesifikt protein eller fenotype. Hvis en region av DNA er blitt sekvensert, kan den screenes for karakteristiske trekk ved gener. For eksempel åpner leserammer (ORF-er) - lange sekvenser som begynner med et startkodon (tre tilstøtende nukleotider; sekvensen til et kodon dikterer aminosyreproduksjon) og blir uavbrutt av stoppkodoner (bortsett fra ett ved avslutning av dem) - veksler på proteinkodende region. Også menneskelige gener ligger vanligvis ved siden av såkalte CpG-øyer - klynger av cytosin og guanin, to av nukleotidene som utgjør DNA. Hvis et gen med en kjent fenotype (som et sykdomsgen hos mennesker) er kjent for å være i den kromosomale regionen som er sekvensert, vil ikke tildelte gener i regionen bli kandidater for den funksjonen. For det andre kan homologe DNA-sekvenser av forskjellige organismer sammenlignes for å plotte evolusjonsrelasjoner både innenfor og mellom arter. For det tredje kan en gensekvens screenes for funksjonelle regioner. For å bestemme funksjonen til et gen, kan forskjellige domener identifiseres som er vanlige for proteiner med lignende funksjon. For eksempel finnes visse aminosyresekvenser i et gen alltid i proteiner som spenner over en cellemembran; slike aminosyrestrekninger kalles transmembrane domener. Hvis et transmembrandomene finnes i et gen med ukjent funksjon, antyder det at det kodede proteinet er lokalisert i cellemembranen. Andre domener kjennetegner DNA-bindende proteiner. Flere offentlige databaser over DNA-sekvenser er tilgjengelige for analyse av alle interesserte.
